双向电泳实验方案

引自刘志文（湖南大学）

1.双向电泳总蛋白(培养细胞）提取方法：

方案一

细胞培养在10cm的培养皿中，待培养至80％左右密度时，细胞用预冷的PBS漂洗3次，加450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打。（折合在六孔板中，每孔加裂解液50μl）

之后将样品用超声波细胞破碎仪超声处理超声时间为5s，间歇时间为10s，功率为100-120W，超声处理至溶液清澈无粘稠物为止，处理过程在冰浴中进行，超声处理后，4℃、25000g离心1h。

取上清进行蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后-80℃冰箱中保存。

（裂解液成分：8mol/L脲，65mmol/L DDT，4％CHAPS，40mmol/L Tris）

方案二

1.1试剂

       （1）抽提缓冲液

                 9mol/L脲                               5.4g

                 4％CHAPS                                0.4g

                 0.5％IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech） 50.0μl

                 50mmol/L DDT                            0.077g

                 H₂O                                     加至10ml

       （2）IPG缓冲液（PH 3-10）（AP Biotech）

        (3) 磷酸盐缓冲液（PBS）,冰冻

1.2仪器

(1) 细胞刮刀

（2）离心机（低温，低速）

         （3）滤纸

         （4）冰浴装置

         （5）超速离心机（低温）

         （6）漩涡混合器

1.3细胞

     

1.4方法

     1.从培养皿中转移细胞：用细胞刮刀从培养皿中刮下细胞，用5ml移液器将培养基和细胞转移至15ml离心管中。

     2.480g、4℃离心沉淀细胞5min。

     3.弃去上清，勿搅动沉淀

           要点：操作一下步骤时，所有细胞需保持冰冻状态；不离心或震荡时保持细胞在冰上。

     4.离心管中加入10ml冰冻PBS,来回吹打重悬细胞。

     5.480g、4℃再次离心细胞5min。

     6.弃去上清，勿搅动沉淀。

     7.重复步骤4-6两次。

     8.在最后一次洗涤后，把离心管完全空干，用滤纸将沉淀上残留的PBS吸干。

     9.用移液器将抽提缓冲液加到离心管中。

            依赖所研究的细胞系来确定抽提缓冲液的体积。细胞裂解液的蛋白质浓度应为10mg/ml，不应超过20mg/ml。

     10.漩涡混合器振荡离心管10-30秒，重新悬浮沉淀。

     11．每1ml抽提缓冲液中加入50μl IPG缓冲液，IPG缓冲液的终浓度是0.5％。

     12．将细胞裂解液转移到合适的超速离心管中。

     13．100000g 离心20min。

     14. 收集上清，小心避免离心管底部的清澈黏性的液滴（DNA和RNA）混入上清。

     15. 用BCA方法测定蛋白质浓度

             注意：如果用BCA检测，要从抽提液中去除DDT，因为DDT会干扰分析。样品分析完之后，在样品中加DDT至终浓度为50mmol/L。

     16．将上清分为几等分，每份100μl或200μl。（每一等分的大小取决于待测样品的量。如果不立即用于IEF，将样品-80℃储存。

     17.按以下方案进行第一向IEF.

 

 

2.第一向IEF.

2.1.试剂

      1.两性电解质载体或IPG缓冲液

      2.二流苏糖醇（DTT）(1mol/L)

      3.IPG凝胶条（为获得可靠实验结果，最好选择使用预制的宽3mm厚约0.5mm的脱水IPG胶条，胶条经水化使用）

      4.矿物油（低粘度）或石蜡油（可选择商业化的产品，如固相化干胶条覆盖液（Immobiline DryStrip Cover Fluid））

      5.水化液

          8mol/L脲                                       48g

          1.5％(质量浓度)CHAPS                           1.5g

          H₂O                                       加至100ml

          将水化液分成2.5～5ml每等份，-20℃

2.2仪器

       1.医用钳子

       2.吸头（1ml）

       3.加样杯（可选）（IPG胶条被水化后，可用加样杯来上样）

       4.带螺丝帽的试管（试管应足够长以盛放凝胶条）

       5.专用IEF系统

       6.带有盖子的长度合适的IPG凝胶电泳槽

              典型长度是7cm、11cm、13cm、18cm、或24cm。用合适的洗涤器清洗电泳槽，再用水彻底清洗，然后用棉签或无棉纸巾擦干，或让其在空气中干燥。

2.3方法

   2.3.1．IPG胶条的水化

       1.在新制备的或温和解冻的水化液中加DTT至终浓度为2g/L。加两性电解质载体或IPG缓冲液至终浓度为0.5％～2.0％。其PH范围与用于分析的IPG胶条的PH范围向匹配。

       2.若在水化期间将蛋白质样品加到凝胶上，则将样品用水化液稀释（或溶解）至每胶条含1mg总蛋白。（上样量取决于实验目的。高丰度蛋白质上样量小，低丰度蛋白质上样量较大）

       3.在IPG胶条的塑料支持物背面标上样品名称。

       4.在溶胀槽里加入适量的水化液（见下表）。将溶液缓缓加入槽中心，要避免产生气泡，除去气泡。记录不同样品所对应的IPG凝胶。可将溶胀槽标号以便确认胶条。

表2.1 建议使用的水化液体积

   说明：在重新水化的同时上样则包含蛋白质样品的体积

       5.从每个胶条上除去保护膜，胶条向下放置于水化槽中。确保溶液浸没整个胶条表面。如有必要，用镊子将胶条末端夹起，来回滑动胶条以保证其完全湿润。避免在胶条下产生气泡。确保胶条和胶条底面的电极丝接触。

       6.在上面加1.5ml的矿物油来防止脲沉淀。将矿物油滴入胶槽一端直至半满，接着在另一端将矿物油加满，不要让矿物油溢出。

       7.室温下，胶条水化至少6h（最好过夜），注意将塑料盖子盖在胶槽上。

       8.用下述方法进行蛋白质等电聚焦。

 

 

   2.3.2用IEF专用电泳装置进行蛋白质IEF

       1.对IEF电泳装置程序的设置：

表2.2专用IEF系统所用IPG胶的建议电泳条件

注意：①水花时间可随实验而变化，但必须大于6h

       ②因样品不同，在建议的时间内可能达不到此电压。因此，最好按照V·h而不是时间设置步骤。

       2.盖上电泳槽的盖子，开始进行等电聚焦电泳(IEF).

       3.电泳结束后，关闭电源，打开电泳槽的盖子。

       4.用镊子夹起胶条，控干胶条上的矿物油，放在平衡管中。对每块胶条都需要重复此步骤。（见2.3.2 IPG胶条的平衡）

       5.进行第二向电泳或胶条放入试管中，储存于－40～80℃。胶条能存放1个月。

   2.3.3 IPG胶条的平衡

       1.试剂

           SDS平衡缓冲液

               50mmol/L  Tris-Cl（PH 8.8）         6.7ml的1.5mol/L  Tris-Cl

               6mol/L 脲                          72.07g

               30％（体积分数）甘油               69ml的87％甘油（体积分数）

               2％SDS                             4.0g

               溴酚蓝                             少许

               用水调节缓冲液至终体积为200ml。分装成40ml每份，储存在-20℃。在用之前（见步骤1）加入DTT至终浓度为10g/L。如果要进行第二次平衡（见步骤2），将典乙胺加入新鲜分装的SDS平衡缓冲液中至终浓度为25g/L。

       2.仪器

         1.印迹纸（3MM）

         2.平衡试管（螺口帽），长度需能装下IPG凝胶条。

         3.往复式或定轨式摇床

       3.样品

          已聚焦的IPG胶条

       4.步骤方法

         1．每10ml SDS平衡缓冲液中加100mg DTT（DTT终浓度为10g/L）。

         2.将IPG胶条放入有螺口的试管中，将塑料支持膜贴于平衡试管壁上。将平衡液

     （来自步骤1）加入每个试管中；对于18cm和24cm IPG胶条，建议10ml平衡液；对于11cm和13cm胶条，建议使用5ml平衡液；对于7cm IPG胶条建议加2.5～5cm平衡液。将平衡试管盖拧紧，置于往复式或定轨式摇床上。

         3.轻摇IPG胶条至少10min，平衡的时间依凝胶条上蛋白质的数目多少而定。如果平衡时间超过20min，样品会发生扩散而丢失。孵育完成时，继续完成步骤4、5，（不完全平衡将导致SDS-PAGE凝胶中出现垂直拖尾。）

         4.（可选）进行第二次平衡，用典乙酰胺来减少第二向分离中的点的拖尾和其他影响（第二向垂直电泳可选或不选此平衡步骤，但对水平SDS凝胶是必须的）。

               a．将第一次平衡后的溶液倾入废液缸中。

               b．将平衡管中加入2ml水，快速的洗1条胶。

               c．弃去水，加适当体积（见步骤2）的含25g/L典乙酰胺的SDS平衡溶液（例如每10ml平衡液中加250mg）。

               d．将平衡试管的盖旋紧，放在往复式或定轨式摇床上轻摇5min。

               e．继续步骤5或进入第二向电泳。

         5.（可选）将IPG胶条放在印迹纸边缘。加H₂O使印迹纸润湿，吸干IPG胶条表面多余的平衡溶液，持续30～60s（吸干IPG表面多余的平衡液有助于减少样品中大量蛋白质的水平拖尾。应把胶条放在第二向胶上之前吸干，然后进行第二向电泳。）

 

 

3.垂直SDS平板凝胶的制备：均一凝胶的灌制

     

（ 均一凝胶对特殊分子量范围的蛋白质有较好的分离效果（普遍使用）；梯度凝胶常用于宽分子量范围的蛋白质，但重复性差。具体实施方案得根据待分离的蛋白质的相关信息确定。）

各种浓度凝胶的配方

    注：如果凝胶要用银氨染色法染色，在凝胶中包含的硫代硫酸钠可减少染色背景水平。在100ml凝胶溶液中加180μl 10％的过硫酸铵溶液，90μl 5％的硫代硫酸钠，180μl TEMED。硫代硫酸钠可轻微抑制聚合作用，因此要使用大量的TEMED。首先在凝胶溶液中加过硫酸铵，其次加硫代硫酸钠，最后加TEMED。

 

3.1试剂

    （为获得良好的分离效果，试剂质量是很中要的，要用电泳级或更好的。在制备胶是要带手套，因为丙烯酰胺是神经毒剂，角蛋白或其他皮肤、毛发蛋白都会污染凝胶。）

1.     过硫酸铵（10％）

              将水加入新鲜的过硫酸铵时，会发出“噼啪”声。若没有“噼啪”声，则因更换新鲜储液。准备1ml过硫酸铵，应现用现配。

2.     正丁醇（水饱和）

              将水饱和的正丁醇在1000ml烧杯中混合。混合后，让正丁醇和水分成两相。水饱和的正丁醇可作为凝胶的覆盖液（步骤11）。

3.     乙醇

4.     4×凝胶缓冲液（1.5mol/L Tris-Cl，PH 8.8）

              在750ml水中溶解181.5g Tris-碱。用HCl调PH 8.8最后加H₂0至终体积为1000ml。用0.45μm滤纸过滤，室温下储存。

       5．凝胶储存溶液

              0.375mol/L Tris-Cl（PH 8.8）

              0.1％ SDS

              125ml 4×凝胶缓冲液，5ml 10％ SDS，370ml H₂O。混合液储存在4℃。

6.单体储存液（30.8％T,2.6％C）

              丙烯酰胺                      150.0g（终浓度30.％，）

              N,N’-亚甲基双丙烯酰胺        4.0g（终浓度为0.8％）

              H₂O                            加至500ml

              通过0.45μm滤纸过滤，于4℃避光保存。

        7.SDS (10％)

        8.5×SDS电泳缓冲液

              125mmol/L Tris-碱             15.1g

              960mmol/L甘氨酸               72.1g

              0.5％ SDS                      5.0g

              H₂O                            加至1000ml

              在室温下储存5×缓冲液，在用前稀释成1×溶液。

        8.TEMED

3.2仪器

       1.凝胶灌制设备（夹子和封闭胶）

2.玻璃平板

             用热的实验室专用去污剂浸泡玻璃板，用软纸巾擦拭玻璃板，再用水清洗。

还可用实验室清洗器清洗玻璃板。经干燥后，将玻璃板存放在无尘环境中。清洗

玻璃板时要带手套以减少角蛋白或其他皮肤蛋白的污染。

        3.磁力搅拌子

        4.磁力搅拌器

        5.吸管（25ml，一次性）

        6.隔片（1.0mm或1.5mm）

        7.真空瓶

        8.水抽真空泵或其他真空装置

3.3方法

       1.安装玻璃板前，用乙醇浸泡过的无棉纸巾擦拭玻璃板，以确保无灰尘颗粒粘在玻

璃板表面。(提示：处理玻璃板时注意带手套以减少蛋白污染)

   2.对齐两块玻璃板，在两边放入1.0mm或1.5mm隔片。

   3.用恰好足够的压力将两块玻璃板及隔片夹住，使其保持在适当的位置。将其底部立于水平面上，保证两块玻璃板底边及隔片相互齐平，锁紧夹子。（玻璃板的底边和隔片相互齐平非常重要，这能降低灌制胶时泄露的可能性。）

   4.将装配好的架子装入灌胶架，转动xuanniu以使胶框（即夹在一起的玻璃板和隔片）卡紧于支架的塑胶条上。

   5.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部，不要用标记笔，因其会溶出渗入凝胶。

   6.用不脱色记号笔在玻璃板的平板外面离上沿约0.5cm处做标记。

   7.在灌胶之前将水加入凝胶框来确认凝胶溶液的体积在灌胶之前从凝胶框中除去全部的水，否则凝胶中丙烯酰胺的浓度会受影响。在真空瓶中配置准确体积的凝胶溶液（由前表计算），TEMED和过硫酸铵的体积忽略不计。

   8.在溶液中加入一个小磁力搅拌子，用水抽真空泵抽几分钟以除去溶液中的空气，在磁力搅拌器上搅拌溶液（虽然并非所有研究者都进行抽空气这步，但为了更佳的重复性，建议进行此步操作。）

   9.在瓶中加TEMED和过硫酸铵，轻轻搅拌至混合，不要产生气泡。

   10.用吸头缓慢加入凝胶（从一个角落滴加），加至距上沿0.5cm处。

   11.立即在胶上方加一薄层（100～500μl）水饱和的正丁醇以避免凝胶暴露在氧气中，并且可使凝胶表面平整。（提示：第二向胶的表面应该很平，这样可更好的与第一向凝胶接触。许多研究者用双蒸水作覆盖液，但这样做可能会凝胶上部稀释丙烯酰胺浓度。）

   12.让胶聚合至少1h。

   13.在聚合之后，检查每块胶是否完全聚合并且均一，同时检测胶的上表面是否水平。用双蒸水或去离子水清洗胶表面。

   14.此胶可用于第二向电泳，并可在4℃储存两周。（储存的胶应该用胶储液覆盖并且用塑料膜紧密缠好）

 

 

 

4.第二向：蛋白质的SDS-PAGE

4.1材料

  4.1.1.试剂

     1.琼脂糖密封液

           5×SDS缓冲液                                20ml

           琼脂糖(见注释)                               0.5g

           溴酚蓝                                       少许

           H₂O                                          80ml

           用低电内渗的琼脂糖，同时建议使用低熔化温度。在500ml锥形瓶中加入所有试剂，混匀悬液。在微波炉中低火加热，直到琼脂糖完全熔解。最好以20s间隔加热，以保证溶液不过于沸腾。加热过程中注意观察，因为溶液很容易过于沸腾。将溶液分装成1.5ml每管，室温或4℃储存。

     2.蛋白质分子量标准（可选可不选，见步骤2）

     3.5×SDS电泳缓冲液

           125mmol/L Tris-碱                            15.1g

           960mmol/L 甘氨酸                             72.1g

           0.5％ SDS                                     5.0g

           H₂O                                          至1000ml

           储存在室温下，用前稀释成1×溶液。

  4.1.2．仪器

     1.滤纸

     2.钳子和多用尺子

           钳子和尺子必须足够薄，以允许在平板胶的玻璃板之间操作IPG胶条（见步骤2）

     3.温度控制仪（预先调整到45℃和100℃

     4.电源

     5.SDS-PAGE凝胶

     垂直电泳设备

4.1.3．生物样品

      已聚焦的IPG胶条

  4.2.方法

         1.在100℃加热琼脂糖封闭溶液使之熔化。每块凝胶约需1ml溶液。完全熔化琼脂糖要花10min，最好在即将平衡IPG胶条时进行。琼脂糖熔化后，将其冷却至40～50℃。

          2.在第二向凝胶表面的平板之间用钳子定位平衡后的IPG凝胶条，保持塑料支持条靠着其中一块玻璃平板。在平板之间用一把薄的软塑料尺子推动IPG胶条，直到IPG胶条底边和凝胶表便紧密接触。从IPG胶条一端至另一端逐渐沿玻璃平板推动胶条。为了避免IPG胶条被撕破，应在凝胶的塑料支持面施力以使IPG胶条放入适当位置。

保证在平板凝胶和IPG胶条之间，以及塑料支持和玻璃平板之间没有气泡。如果有气泡，轻压IPG胶条的塑料支持赶走气泡。如果气泡在第二向凝胶上方，不要过重地压IPG胶条表面，那样可能会使SDS-PAGE凝胶上表面的孔径缩小。

          3.如果需要分子量标准，将准确剂量的分子量标准（对考马斯染色来说需200～1000ng；对银染来说，需10～50ng）和已熔化的琼脂糖封闭溶液混合，吸取15～20μl此混合物至一小张滤纸上。

          4.琼脂糖凝固后，将滤纸夹在两个玻璃平板之间，以便它在IPG 胶条末端和平板凝胶上部相连接。

                如果凝胶将用于印迹，用抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶或抗生物素蛋白-碱性磷酸酶作蛋白质检测，可使用酰化标准。所使用的生物素酰化标准量见操作指导手册。

          5.缓慢吸取熔化的琼脂糖封闭溶液至IPG胶条上，避免产生气泡。在继续下述步骤之前，琼脂糖应冷却并凝固至少1min。

                在琼脂糖内包埋凝胶条是为了固定胶条使之处于正确的位置，确保IPG胶条和凝胶之间的良好连接。

          6.按照操作指导手册，完成电泳装置的安装。连接冷却装置(如果有的话)，使其

保持凝胶温度在10～15℃。

                虽然冷却不是必须的，但这样可以大大减少凝胶之间的变化，并允许凝胶在高流下电泳，这样可减少电泳时间。

                建议标准和大型胶应冷却，冷却可大大提高凝胶之间的重复性，有助于减少人认为的影响。如果实验室温度有大的波动冷却就非常重要了。

          7.按方案中表4.1或4.2中建议的电泳条件来设置电泳仪，打开电源，开始电泳。

 

表4.1第二向垂直电泳中建议使用条件

   注意：①表中所显示的时间仅仅是估计的，当染料距凝胶0.5～1.0cm时停止电泳。

 

               电泳分两步进行：第一步持续时间较短，使用地低电流或低功率设置，使蛋白质产生最初的迁移和堆积，在电泳开始5～15min后（见表4.1和表4.2），检查溴酚蓝是否已进入凝胶；第二步，电流或功率要升高以允许快速分离。

          8.当溴酚蓝达到凝胶底部0.5～1.0cm时，关掉电源，从电泳槽中将凝胶移出。

          9.将凝胶水平放置，除去隔板，小心不要损坏凝胶，用塑料弹性刀片小心的将两

块玻璃平板分开。不要用金属切片，因其会在玻璃板上留下划痕。凝胶应该贴于其

中一块玻璃板。

          10.立即进行凝胶染色或蛋白质的转膜。（提示：切忌让凝胶干燥！如果必要，凝胶留在电泳槽中，继续完成下一步方案的准备工作）

 

表4.2  对大型凝胶的第二向垂直电泳建议使用的电泳条件

 

   注意：①表中所示时间仅为估计值。当染料到达距凝胶底部0.5～1.0cm时停止电泳。这里所给出的值是基于在所给温度下冷却系统容量的限制及12块凝胶的量而定的。若同时电泳的凝胶数少于12块，功率应升高，这样可减少电泳的时间。这些值可在Ettan DALT IT系统进行选择。

 

 

5.胶体考马斯亮蓝染色（检测限8～50ng）

5.1 材料

   5.1.1 试剂

       1.考马斯亮蓝G250                     10ml，50g/L，溶于水中

            将溶液搅拌几分钟以促进染料的溶解，此染料不会完全溶解。

       2.染料储备液

            硫酸铵                                  50g

            85％磷酸                                6ml

            5％考马斯亮蓝G-250溶液                 10ml

            H₂O                                     加至500ml

       3.固定液

            10％（体积分数）                       乙酸

            40％（体积分数）                       甲醇

            配制1L

       4.甘油（5％）

       5.甲醇

   5.1.2 仪器

       1.玻璃平皿或塑料平皿（平皿应比需要染色的凝胶大）

       2.往复式或定轨式摇床

   5.1.3 蛋白质样品

       包含蛋白质样品的凝胶

5.2 方法

       1.将凝胶置于玻璃或塑料培养皿中固定，轻轻摇动至少1h。

              可将凝胶固定过夜。如果凝胶有标记，多个凝胶可在同一培养皿中固定，固定液的体积应足够大，以使所有凝胶都能固定流动。

        2.移走固定液，在摇床上用水清洗凝胶10min。

        3.弃去水，重复洗2次。

        4.在洗第3次时，将4份考马斯亮蓝储备液和1份甲醇混合，以制备胶体考马

斯亮蓝染液。

           5.将凝胶放在100～300ml胶体考马斯染料内（染料的体积依胶的大小而定，确保染料覆盖凝胶）。在往复式或定轨式摇床上轻摇过夜。

           6.去除残留染料，将凝胶转移至盛有45～55℃双蒸水或去离子水的干净平皿

中。当水变色时弃去，再次用新的45～55℃的H₂O轻轻摇晃清洗凝胶。重复几次，直到蛋白质带较凝胶背景变得明显，蛋白质将在清晰的背景上出现蓝色。

           7.凝胶可用于扫描分析。扫描湿凝胶较好，因为若凝胶干燥易破裂，导致数据的丢失。

           8.在干燥之前，将凝胶浸在5％甘油中30min，凝胶也可以装在密封的塑料袋中，储存于4℃。

 

 

除了考马斯亮蓝染色外也可以用银染方案。银染检测限达到2～4ng，但其对外界干扰非常敏感，故需要更高要求的试剂和操作。（此处我未列出，是不是有需要还得根据具体情况来定）

 

 

参考资料：

1.蛋白质和蛋白质组学实验指南                     理查德J.辛普森 主编

2.蛋白质电泳实验技术                             郭尧君  编著

3.蛋白质化学与蛋白质组学                         夏其昌 曾嵘  编著

4.双向电泳简易操作指南                           湖南师大内部资料

 

 

附：特殊试剂处理方法

乙酸（冰醋酸）：具有强腐蚀性，使用时要非常小心。液态或雾状的乙酸能够严重损害所有的人体组织。吸入、摄入或皮肤吸收，都会对身体产生危害。使用时要带合适的手套和防护眼镜，并在化学通风橱中操作。远离热源、火星和明火。

丙烯酰胺（非聚合状态）：是一种有效的神经毒素，它可以通过皮肤吸收到体内(有累积效应)。避免吸入其粉尘。在称量粉末状的丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺时要戴手套和口罩，且在通风橱中进行。聚丙烯酰胺无毒性，但在使用时也要小心，因为其中可能含有少量的非聚合的丙烯酰胺。

过硫酸铵：对粘膜组织和上呼吸道，眼睛和皮肤非常有害，吸入可能致死。使用时要带合适的手套、防护眼镜和防护服，并只能在化学通风橱中进行。使用后要彻底清洗。

硫酸铵：若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜，并在化学通风橱中进行。

溴酚蓝：若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜，并在化学通风橱中进行。

正丁醇：对粘膜、上呼吸道、皮肤特别是眼睛都有刺激性。避免吸入其挥发的气体。使用时要戴合适的手套和防护眼镜，并在化学通风橱中进行。正丁醇也有极强的可燃性，远离热源、火星和明火。

考马斯亮蓝：若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜，并在化学通风橱中进行。

DTT（二流苏糖醇）：强还原剂，散发恶臭。若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害。无论是固态还是高度浓缩的液态，使用时都要戴合适的手套和防护眼镜，并在化学通风橱中进行。

乙醇：若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜，并在化学通风橱中进行。

甘氨酸：若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜。避免吸入其粉尘。

甲醇：有毒，可导致失明。若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害。注意空气流通，限制其挥发。避免吸入其蒸气，使用时一定要在化学通风橱中，戴合适的手套和防护眼镜操作。

典乙酸：见乙酸。

磷酸：有强腐蚀性，若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜。避免吸入其蒸气。

TEMED（四甲基乙二胺）：对眼睛和粘膜有腐蚀性，若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜。

CHAPS:有刺激性，若吸入、摄入、或皮肤吸收，会对人体有害，使用时要戴合适的手套和防护眼镜。避免吸入其粉尘。

 

 

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