ImmunoFluorescence（细胞）

1．  细胞固定：

PBS清洗三遍后, （可选方案）
a. 用PBS(pH7.4) 配置3.7% PFA（多聚甲醛） 室温15min [能保存大部分蛋白]
然后再用0.1 triton x-100 in PBS 打孔~2-5min,RT [1%triton in PBS母液]
b. 用冰冷甲醇-20℃ -20℃ 6min [方便，细胞内游离蛋白被抽提得厉害]
c. 甲醇：丙酮（1：1） -20 ℃ -20℃ 6min [用丙酮中和甲醇的抽提作用]
（一般来说，对于一个未知的蛋白，最好使用三种固定方案，然后进行对比。因为不同方案固定后，标出的荧光并非定位一致。对于一些特别的细胞器，要注意细胞器的生理状态：微管不能在0℃ 搁置太长时间；线粒体最好使用3.7% PFA固定；但标γ-tubulin必须用冰甲醇固定强化抽提以去除背景。）
出现细胞脱落盖玻片的现象，此时勿必要小心处理。最好把盖玻片留在细胞培养的dish中，沿着dish的四周轻柔注入PBS及固定液，特别是加-20度的甲醇之类时，要小心，固定液很容易快速把铺层的细胞掀起。可以先注入至dish的一角，然后快速把液体铺盖在细胞上。
多聚甲醛配置方法：把PBS加热到大约80度，把粉末状多聚甲醛加入到热PBS中，稍微加入几颗固体的NaOH，放在摆床上溶解~5min，然后置于冰上冷却，冷却后用HCl调节pH值至7.4。现配现用。不建议冻存。）

2．（可选步骤）细胞等渗处理

2 X PBS(triton x-100 0.1%) 4℃浸泡15~20分钟，一般在有机物固定后细胞核会出现皱缩等现象，致使细胞形态很难看。此步处理可以缓解形态差异。

3．（可选步骤）BSA去杂处理 [对于有杂质或抗性不好的抗体可以考虑]

1% BSA in PBS 4℃处理细胞10分钟。只需少量的BSA in PBS，可以把1%BSA in PBS配置好后并存于-20℃，使用前化开，滴一滴于盖玻片上。

4. 一抗标记

（按抗体使用说明稀释于PBS中，一般为western blot的十培浓度。）
1X PBS 清洗盖玻片3次，置于parafilm上，有细胞一面朝上。
滴加~50ul Ab in PBS 于盖玻片（12mmX12mm）上，铺展覆盖细胞。 室温结合2H。

此时清洗一般为放置三个装有PBS的小烧杯，用镊子夹着盖玻片，让盖玻片每个烧杯中蘸洗数次，如果细胞容易脱落，请轻轻把盖玻片插入PBS液体中，等待几秒后轻轻抽出。重复一两次。

5．二抗标记

（一般使用1:200稀释于PBS中，可以适当增加浓度。）
1X PBS清洗三次，置于parafilm上。
滴加~50ul Ab in PBS 于盖玻片（12mmX12mm）上，铺展覆盖细胞。 室温结合2H。

6．封片

1X PBS 清洗三次，在滤纸上轻轻一靠，把有细胞一面朝下扣在滴有封片剂的载玻片上。

7．保存

Mowoil封片后几分钟，用指甲油轻轻涂抹控制住盖玻片四周（手法请询问女同志），以备油镜镜检时不会渗油。长期保于4度，必需要用指甲油封存。